近日，生命科学技术学院和农业微生物资源发掘与利用全国重点实验室生物固氮团队研究成果以“GmNAC039 and GmNAC018 activate the expression of cysteine protease genes to promote soybean nodule senescence”为题在线发表于植物细胞（Plant Cell），研究揭示了大豆GmNAC039和GmNAC018直接靶向于多个根瘤衰老关键基因GmCYPs促进根瘤衰老的分子机制，为大豆氮素高效吸收和高蛋白大豆培育提供关键基因资源。该文章同时被期刊编辑选为亮点工作进行评论（Doll, 2023）。
大豆与根瘤菌共生互作形成高效共生固氮体——根瘤，为大豆生长发育以及子粒蛋白含量提供约65%氮素来源。然而，根瘤共生固氮效率受其发育过程的严格调控，大豆根瘤固氮的终止即根瘤衰老，往往发生在大豆生殖发育阶段的始荚期。在农业生产中，大豆生长发育后期的田间施肥可以显著提高产量和大豆子粒蛋白含量，其主要原因是大豆子粒发育对氮素需求量的剧增。因此，适当延迟根瘤衰老是减少田间施肥并保证大豆子粒蛋白含量的一个关键手段。根瘤衰老过程受宿主自身发育以及各种环境因素调控，根瘤衰老表现为根瘤豆血红蛋白含量降低、根瘤颜色变化、固氮活性降低以及衰老标志基因如木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶（CYPs）的高度表达等，最终导致根瘤坏死和脱落。然而，根瘤衰老是如何被激活尚不清楚。
该研究以大豆根瘤为研究材料，首先对不同生长时期根瘤的表型以及固氮能力进行检测，基于根瘤固氮酶活性、豆血红蛋白基因表达水平等变化，选择根瘤菌接种4周、8周和12周的大豆根瘤作为研究材料，对大豆衰老根瘤的转录组进行系统分析。基于大规模毛根转化实验，对10个NAC转录因子进行功能研究，最终筛选到GmNAC039与其直系同源基因GmNAC018是介导大豆根瘤衰老的关键转录因子。
为了进一步确定GmNAC039和GmNAC018调控大豆根瘤衰老的作用，研究人员借助于CRISPR-Cas技术构建了GmNAC039和GmNAC018双突变体，以及GmNAC039、GmNAC018和GmNAC030三突变体。研究发现，GmNAC039和GmNAC018的过表达显著促进根瘤衰老，而GmNAC039和GmNAC018的敲除突变体则显著延缓根瘤衰老，明确了GmNAC039和GmNAC018在介导大豆根瘤衰老中的关键作用。
为了进一步解析GmNAC039和GmNAC018调控大豆根瘤衰老的分子机制。建立了根瘤共生细胞的nCUT&Tag技术，结合转录组分析以及EMSA等方法，鉴定到了GmNAC039调控的靶基因。GmNAC039可以直接靶向多4个半胱氨酸蛋白酶基因GmCYPs的启动子并激活它们的转录。研究发现，过表达4个GmCYPs基因都可以显著促进根瘤衰老，而同时敲除4个GmCYPs基因则延缓大豆根瘤衰老，提高了根瘤的固氮活性。以上结果表明GmCYPs在介导根瘤衰老中发挥重要作用。
在本研究中，研究人员解析了大豆根瘤衰老的分子机制。鉴定到两个NAC转录因子——GmNAC039及其同源基因GmNAC018，是大豆根瘤衰老的关键调节因子。GmNAC039通过直接调控4个GmCYP基因的表达来调控根瘤衰老。研究不仅建立了NAC-CYP分子模块调控大豆根瘤衰老的模型，也为大豆氮素高效吸收提供关键理论依据。
华中农业大学博士后余海翔和肖爱芳为文章的共同第一作者，博士生吴佳姗等参与了研究工作，曹扬荣教授为通讯作者，东北农业大学农学院陈庆山教授参与合作研究。该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金以及生科院龙云计划和百川计划等项目支持。
【英文摘要】
Root nodules are major sources of nitrogen for soybean （Glycine max （L.） Merr.） growth, development, production, and seed quality. Symbiotic nitrogen fixation is time-limited, as the root nodule senesces during the reproductive stage of plant development, specifically during seed development. Nodule senescence is characterized by the induction of senescence-related genes, such as papain-like cysteine proteases （CYPs）， which ultimately leads to the degradation of both bacteroids and plant cells. However, how nodule senescence–related genes are activated in soybean is unknown. Here, we identified two paralogous NAC transcription factors, GmNAC039 and GmNAC018, as master regulators of nodule senescence. Overexpression of either gene induced soybean nodule senescence with increased cell death as detected using a TUNEL assay, whereas their knockout delayed senescence and increased nitrogenase activity. Transcriptome analysis and nCUT&Tag-qPCR assays revealed that GmNAC039 directly binds to the core motif CAC（A）A and activates the expression of four GmCYP genes （GmCYP35, GmCYP37, GmCYP39 and GmCYP45）。 Similar to GmNAC039 and GmNAC018, overexpression or knockout of GmCYP genes in nodules resulted in precocious or delayed senescence, respectively. These data provide essential insights into the regulatory mechanisms of nodule senescence, in which GmNAC039 and GmNAC018 directly activate the expression of GmCYP genes to promote nodule senescence.
论文链接：https://doi.org/10.1093/plcell/koad129
