梨组织培养研究进展及其在育种中的应用

　　梨组织培养为梨优良品种的保存与改良、遗传转化体系建立、基因功能研究提供了有效途径。本文综述了国内外近年来梨组织培养研究现状，重点对外植体类型、基础培养基及其添加物、培养条件等因素对梨组织培养的影响进行概述。提出了现阶段梨组织培养存在的问题及对策，以及在育种中的应用和前景展望，以期为今后的梨组培研究提供参考。

 

 

　　植物组织培养技术起源于1902年德国植物学家哈伯兰特提出的植物细胞具有全能性的概念。梨组织培养的研究始于20世纪30年代，70年代后关于梨及其砧木的组织培养的报道才逐渐增多，并且开始进行商业性生产。目前，梨的组织培养工作已经取得了不少成果，根据培养的目的不同而采用不同的外植体，国内外研究人员已对茎尖、茎段、叶片、子叶、花药、原生质体等外植体成功进行了培养，其中叶片培养和茎尖培养的相关研究较多。

 

 

　　梨树的不同组织或器官都可作为外植体进行组织培养，但不同的外植体的再生能力不同，因此，选择合适的外植体是组织培养成功的关键。

 

　　叶片是梨遗传转化中普遍采用的外植体。叶片再生方式有间接再生和直接再生，大多数梨品种的叶片再生方式是间接再生，即从叶片愈伤组织产生不定芽。最早于1988年，Laimer等用西洋梨康弗伦斯试管苗叶片诱导愈伤组织形成球状结构，但是效果不佳，仅有少量球状结构转化成不定梢。随后Abu-Qaoud等于1991年在改变氮源比例的条件下，证明了氮素对梨叶片外植体的不定芽再生是至关重要的。目前，国内学者对叶片组织培养的研究也获得了一些成果，钟颖等通过筛选不同生长调节剂质量浓度组合以及附加不同质量浓度的硝酸银（AgNO3）建立了库尔勒香梨的再生体系，愈伤组织诱导率为100%，不定芽形成率84.92%。王月等对梨矮化砧木青砧D3叶片进行了高效再生体系的构建，不定芽再生率达100%，根诱导率达100%。迄今为止，雪花梨、秋子梨、南果梨、苹果梨、西洋梨红星等均已建立叶片再生体系。

 

　　茎尖属于分生组织，分裂最为活跃，几乎不含病毒，茎尖培养的主要目的是脱除病毒和快速繁殖。梨病毒已报道的有20余种，发生较普遍的有苹果茎痘病毒（ASPV）、苹果茎沟病毒（ASGV）和苹果褪绿叶斑病毒（ACLSV）等。所以，实行苗木脱毒对果品生产具有重要意义。早在1979年Lane首次对梨的茎尖进行离体培养，并获得了完整的植株。随后国内学者赵惠祥于1982年以锦丰和早酥实生苗的茎尖为外植体培养获得植株。苗冉冉等以津香蜜和巴梨的新梢为材料，建立了组培快繁体系，增殖系数达到5.73和3.83。王胜男等对京白梨的茎尖离体培养进行了研究，摸索出了最佳的增殖和生根培养基配方。到目前为止，茎尖培养已在黄冠梨、库尔勒香梨、早酥、中香梨、南果梨等品种上获得了成功。

 

　　茎段、芽等器官也可作为外植体进行组织培养。茎段培养可以分为有芽茎段培养和无芽茎段培养，相比于无芽茎段培养，有芽茎段培养更容易成功。孙清荣等以西洋梨红茄的有芽茎段为外植体，进行腋芽诱导萌发，成功获得了无菌苗。刘春等在对京白梨花芽进行离体培养时，发现1/2MS比MS更有利于愈伤组织的分化，但出芽率较低，并且筛选出了1.5mg/L GA3对花芽愈伤组织诱导具有积极作用，45d后分化出完整植株。

 

　　目前，梨组织培养主要以叶片和茎尖为外植体材料进行组织培养，通过不同培养途径获得再生植株。另外，也有部分研究通过培养子叶、花粉、胚、原生质体等得到了再生植株。通过比较，发现以器官直接诱导和诱导愈伤组织形成的再生植株，再生率较高。

 

 

　　外植体的消毒灭菌工作是植物组织培养技术中关键的一步。梨在生长过程中常年暴露在外界环境中，顶芽、茎和叶等器官容易附生或共生多种微生物。应用科学的灭菌方式能够消灭外植体表面的细菌和真菌，在降低褐变率的同时，最大程度地减少外植体本身携带的污染保证成活率。

 

　　一般先将外植体用洗衣粉或洗洁精浸泡30min，再用流水冲洗1h以上，在超净工作台上采用75%乙醇（C2H5OH）消毒30s，无菌水冲洗3~5次，再用0.1%升汞（HgCl2）消毒3~10min，无菌水冲洗3~5次；或者2%~5%次氯酸钠（NaClO）消毒8~15min，无菌水冲洗5~6次，取出置于无菌吸水纸上吸去其表面多余水分。现有的研究结果表明，相比于次氯酸钠，升汞的消毒效果较好。刘春等对京白梨芽采用2%次氯酸钠和0.1%升汞溶液进行消毒处理，结果表明前者污染率为33%，后者污染率为18%。然而，由于升汞的剧毒性质，不利于试验操作和废液处理，对人体也有较大危害。Arab等对于G×N15（扁桃×桃杂交）砧木的研究表明，纳米银（NS）浸泡外植体或添加到培养基中均可减少内部、外部污染，也许不久后可以作为升汞的合适替代品。

 

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　　培养基是决定植物组织培养能否成功的最关键因素，通常由基础培养基添加植物生长调节剂和其他添加物构成。不同品种或同一品种不同的外植体，由于其基因型和外植体类型不同，其组培增殖能力、再生率和生长状态等都存在显著差异，适宜的培养基类型、植物生长调节剂的种类和浓度等也不尽相同。

 

 

　　培养基是培养优良组培苗的基础，筛选适宜不同品种及其外植体的培养基是组织培养研究的一项核心内容。培养基类型主要有液体培养基和固体培养基，在梨组织培养中一般以固体培养基为主，根据培养目的，又可细分为诱导（再生）培养基、增殖培养基和生根培养基3类。目前，梨组织培养中常用的基本培养基主要有MS、1/2MS、NN69、WPM、B5、QL等。

 

　　赵亚楠等采用交叉组合设计，从MS、1/2MS、WPM和NN69 4种培养基中，筛选出NN69是最适合杜梨组培苗生根的基础培养基。卢明艳等以抗寒耐盐碱梨砧木优系1-127为试材，证明WPM是其增殖和生根培养的最适培养基。孙清荣等通过比较红星梨无菌苗在不同继代培养基上的增殖生长，得出1/2MS培养基比MS、QL更有利于提高无菌苗的增殖效率。王胜男等通过摸索最适合京白梨增殖培养与生根培养的培养基，得出MS是最适宜的增殖培养基，1/2MS是最佳生根培养基；苗冉冉等在建立津香蜜和巴梨组培快繁体系时也得出了类似的结论。Lane等对日本砂梨品种的叶片进行离体培养，发现B5要比MS更有利于叶片再生；而秦璐等以库尔勒香梨叶片为试材诱导不定芽再生，结果表明NN69相比于MS、B5具有更高的再生率。

 

　　以上研究结果说明，不同品种或同一品种不同的外植体，在不同培养阶段适用的培养基类型有所差异。但MS是梨组织培养中常用的培养基类型且多用于继代增殖培养，而1/2MS则更适合作为生根诱导培养基。NN69对梨叶片不定芽诱导的高效性已经被很多人证实，目前多用于作为梨再生试验的基本培养基。

 

 

　　植物生长调节剂种类及配比对梨的离体再生效果起着关键性的作用。有研究认为，培养基中生长调节剂的种类、浓度及配比不同造成组培材料生长和分化能力的不同，可能是因为它们刺激了不同基因控制的酶类，从而影响内源激素的分布水平，进而在生长和分化上形成差异。目前，在梨组织培养中，主要应用的生长调节剂包括生长素类、细胞分裂素类以及赤霉素类等。

 

　　生长素类物质是梨组织培养中不定根诱导所必需的，常见的类型有：萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、吲哚丁酸（IBA）和2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）4种。王金祥等已经证明，IAA是启动不定根形成的重要因子，在根原基诱导阶段起着至关重要的作用。相比于IAA，IBA更加稳定，可以刺激嫩叶和嫩芽形成的IAA运至基部，从而促进生根。NAA虽然不直接参与根的形成，但它可以促进组培苗中的淀粉水解为还原糖，有利于不定根的形成。生长素单一使用与混合使用对不同梨品种生根的作用是不同的。赵亚楠等通过筛选杜梨组培苗不定根原基诱导的激素配方，发现单独使用1.0mg/L IBA的生根效果较好，但IBA和IAA各1.0mg/L混合处理时却抑制了组培苗的生根，而使用IAA和NAA各1.0mg/L的组合时生根率和生根数达到最高，说明合适的生长素组合共同诱导杜梨组培苗生根效果优于单一生长素处理。2,4-D具有促进细胞分裂和生长的作用，常应用于愈伤组织诱导，但是在梨组织培养中应用较少，常用的生长素类物质是NAA、IAA和IBA 3种。

 

　　细胞分裂素常见的类型有苄氨基腺嘌呤（BA）、噻苯隆（TDZ）、玉米素（ZT）和激动素（KT）等。相比于TDZ，BA能诱导产生更多的腋芽，增殖效率更高，而TDZ比BA更有利于促进无菌苗叶片的伸展增大，更有利于壮苗生长。细胞分裂素通常与生长素一起使用，二者相辅相成，能够达到更好的培养效果。王月等在研究不同浓度TDZ和IBA对青砧D3离体叶片不定芽再生的影响时，发现TDZ和IBA组合使用效果优于单独使用，当3.0mg/L TDZ和0.3mg/L IBA组合时不定芽再生率和再生芽数均达最高，分别为100%和7.69个，而单独使用TDZ时不定芽诱导率为86.67%。苗冉冉等也证明了BA和NAA的组合更适合津香蜜和巴梨的继代增殖培养。ZT主要在梨体外器官发生细胞分化中起重要作用，但实际中不常用。然而在对其他植物的组培研究中，张虎等发现ZT对芫花茎段外植体上腋芽萌发的促进效果显著优于BA；魏丽萍等证明了含KT的培养基诱导药用植物山乌龟的不定芽效果优于TDZ。在梨组织培养中常用的细胞分裂素类物质是BA和TDZ。一般来说，生长素与细胞分裂素的比值较低，则有利于促进不定芽形成；生长素与细胞分裂素的比值较高，则有利于促进不定根的形成。不同的品种其最适宜的生长素和细胞分裂素的种类和浓度也各不相同。

 

　　赤霉素类（GAs）在木本植物组织培养的研究中应用较多的是GA3，其作用类似于生长素，但又有所区别。GA3对芽的增殖和伸长有一定的促进作用，但一般不单独使用，通常与生长素和细胞分裂素组合使用能够取得较好的效果。刘春等发现，在6-BA浓度不变的条件下，降低NAA浓度、提高GA3浓度或提高NAA浓度、降低GA3浓度均能促进梨组培苗的增殖。另外，在进行组织培养之前，对外植体进行一定浓度的GA3预处理是有利于生长的。陈丽静等对南果梨茎尖进行0.1mg/L GA3预处理1周，其生长增殖率能达到84%，同时也发现GA3没有促进根的生成反而起抑制作用。

 

　　多胺（Polyamines）是普遍存在于植物体内的另一种植物生长发育调节物质，以精胺、亚精胺、腐胺3种最为常见，一些多胺有利于生根和芽增殖，而另一些多胺则有利于胚胎发生、愈伤组织诱导和次生代谢产物的产生。闫帅等以杜梨继代苗为材料，分别在生根诱导0、3、7、10、15d后，测定分析了基部茎段多胺类物质含量，结果表明亚精胺在杜梨不定根诱导和发生过程中起重要调节作用。崔宝明研究发现，外施72.6mg/L亚精胺可显著提高玉米芽再生效率，但在梨上还未见多胺类生长调节剂对再生效果的报道。此外，油菜素内酯（Brassinolide）作为一种新型生长调节剂在植物组织培养中也有应用研究。张娅等在甘蔗组织培养研究中发现，油菜素内酯及其类似物对其不定根诱导和再生培养体系构建的促进效果明显，在添加5mg/L油菜素内酯培养基上生长的材料有更强的生命力及更高的成活率，而梨上尚未见相关报道。

 

　　生长素、细胞分裂素和赤霉素是现阶段梨组织培养中应用较为广泛的生长调节剂，研究内容主要是以1种生长素搭配1种细胞分裂素的组成方式配比，在继代培养中还需添加一定浓度的赤霉素以达到促进新梢生长的作用。关于多胺、油菜素内酯等生长调节剂在梨组织培养中应用的报道不多，研究内容较单一，没有涉及与其他生长调节剂的互作关系，今后可考虑往这一方面进一步深入研究。

 

 

　　碳源一般是糖类物质，是植物组织培养中渗透压的调节物质及能量的主要来源，同时还可以调控与植物新陈代谢有关基因的表达来影响植株的生长发育。梨组织培养中常用的碳源物质有蔗糖、山梨醇、葡萄糖等，不同品种所适宜的碳源不尽相同。孙清荣等通过研究碳源对西洋梨品种红星叶片不定梢再生能力的影响，发现d-山梨醇相比于蔗糖更有利于提高离体叶片不定梢再生率。因此，在植物组织培养工作中应当要考虑到适合该品种的碳源种类及浓度。

 

 

　　活性炭（AC）具有吸附作用，在植物组织培养中，添加一定量的活性炭可吸附植物分泌的有害物质，同时可提供生根的暗环境，有利于根的诱导和根系生长，防止褐变，提高培养体内可溶性蛋白和总糖的含量。栾晓龙等通过分析不同的活性炭含量对秋子梨组培苗生长的影响，结果表明加入活性炭的组培苗在生根率、生根数、根长等方面均显著高于对照组，并筛选出了最适宜秋子梨生根的培养基为1/2MS＋IBA（0.5mg/L）＋AC（1.0g/L），生根率达到了90%。

 

 

　　在梨再生培养基中添加一定浓度的硝酸银（AgNO3），可以有效提高叶片不定芽的再生率。钟颖等通过建立库尔勒香梨叶片再生体系，发现AgNO3浓度为0.5mg/L与TDZ和IBA组合，有利于库尔勒香梨叶片愈伤组织诱导不定芽。另外，有研究表明，AgNO3通过竞争乙烯的作用位点抑制乙烯的合成及信号的传导，能够控制和逆转组培苗的玻璃化现象。

 

 

　　近年来，国内外学者对纳米硅材料展开了深入研究，并且开始应用于植物组织培养领域。研究表明，在某些情况下纳米硅通过参与植物自身组织或细胞器的构建，影响其生理活性物质的合成，从而调节生理代谢活动，同时影响植物的生长发育。Avestan等在琼脂诱导渗透胁迫条件下，在培养基中添加50~100mg/L纳米硅可以显著提升苹果外植体的增殖率，研究表明使用纳米硅可以改善植物生长和对压力的耐受性。崔云浩等以甜椒幼苗为材料，探究盐胁迫下外源喷施纳米硅对甜椒生长和生理特性的影响，结果表明纳米硅通过调节甜椒植株体内抗氧化酶活性，降低植株氧化损伤，从而提高甜椒的耐盐性。目前，纳米硅在梨组织培养上应用的报道比较罕见，有待进一步研究。

 

 

　　光照条件对梨叶片不定芽发生和组培苗不定根诱导具有重要影响。发光二极管（LED）由于其低能耗、低热辐射、特定波长辐照等特点，已逐渐取代荧光灯（FL）成为植物组织培养的常用光源。Lotfi等以梨组培苗为材料比较蓝光、红光和远红光LED光源对其增殖和生根的影响，结果表明蓝光促进愈伤组织的重量增加，远红光有利于枝梢数量的增加但枝梢质量较差，红光更有利于生根，生根率达到100%。另外，Dimitrova等发现，白光加蓝光LED灯组合能够显著增加梨组培苗的株高。

 

　　通常条件下，外植体经过一定时间的暗培养可产生大量生长状态良好、健壮的愈伤组织，这类愈伤组织易于继代培养和不定芽、不定根诱导。王月等研究发现，青砧D3离体叶片接种后暗培养7d愈伤组织开始产生，暗培养14d移至光下培养（光照时间16h/d），4d后开始有不定芽的产生。赵亚楠等进行杜梨组培苗生根培养，采用混合光（红∶蓝∶白＝3∶1∶1），先暗培养7d后移至光照培养（光照时间14h/d，光照强度2000~2500lx），生根率达到了96%。

 

 

　　在植物组织培养中，一般采取最适温度并保持恒温培养。梨组织培养中一般采用23~26℃的温度进行培养，低于15℃培养的组织生长停滞，而高于35℃对生长不利。房洪舟等探讨了不同温度对刺梨愈伤组织增殖倍数的影响，结果表明愈伤组织增殖倍数在3个培养温度（20、25、30℃）中表现出了较大的差异，其中25℃下培养的生长速度最快、增殖倍数最高。

 

 

　　pH值是植物组织培养过程中能否正常吸取营养物质的重要影响因素。另外，pH值能够影响培养基的凝固程度，当pH值较低时培养基难以凝固，而较高时培养基比较坚硬不利于接种。梨组织培养中，pH值一般设置为5.8就能够取得良好的效果。

 

 

　　在梨组织培养中，污染表现可以分为真菌污染和细菌污染。真菌污染通常来源于空气，孢子在适宜的环境中会迅速地增长，对组培设备、容器等造成污染，其明显的特征在于产生面积较广的菌落，同时还会形成多种颜色的绒毛状菌斑，且带有霉味；而细菌污染一般是由外植体内部与体表携带细菌引起的污染情况，病原菌大部分存储在植物内部，通过一定的载体进行传播，其特征主要以黏液状物体、浑浊水迹状以及泡沫发酵状等多种形态表现，影响较为严重。

 

　　常采用的组培污染防治方法是在培养基中添加各种杀菌剂。卢明艳等以秋子梨污染组培苗为材料，研究山农一号杀菌剂对污染组培苗抑菌效果和生长的影响，结果表明，山农一号I型和III型杀菌剂配合使用对污染组培苗有显著的抑菌效果，并且组培苗的恢复率在70%以上，增殖倍数在1~3倍。白一苇等利用含有25mg/L头孢霉素＋30mg/L代森锰锌与百菌清1∶1混合液的培养基，并在外植体插入培养基前利用100mg/L多菌灵药液或100mg/L代森锰锌与百菌清1∶1混合液进行浸润包衣，可显著降低组培材料被污染的风险，且对除愈伤组织以外的外植体的生长发育影响较弱。

 

　　除此之外，在进行组培前要科学合理地选择外植体，选好外植体之后，对其进行细致清洁和消毒，接种前对设备消毒、人员卫生控制以及紫外灯照射消毒等措施也能够减轻污染程度。

 

 

　　梨外植体在组培过程中极易发生褐化，给梨无菌系的建立带来了极大困难。褐化发生机制分为由多酚氧化酶作用于酚类物质引起的酶促褐化，以及由组培伤口、培养条件导致的胁迫褐化2种类型。

 

　　一般外植体中酚类物质含量及多酚氧化酶的氧化活性在春季较弱，以后逐渐增强使褐变加重。有研究表明，适度的低温对梨茎尖的酶促褐变有显著的抑制作用，但是低温处理会对外植体后期生长带来不利影响，处理时间不宜过长。通过在培养基中加入活性炭、抗氧化剂等，褐变程度均显著降低。另外，刘杰等发现，梨组培苗的多酚物质含量大大低于田间外植体材料。因此，在建立梨离体再生体系时，可以考虑以室内枝条水培催出的嫩芽为外植体进行接种。

 

 

　　由于梨的童期长、基因高度杂合、遗传背景复杂，使得常规的育种周期长、成效低、工作量大。随着近些年分子生物学的发展，遗传转化技术能够通过定向引入外源基因，提高改良效果，加快育种进程，而高效的组织培养再生体系的建立则是基因转移的前提条件。20世纪90年代随着梨叶片再生体系相继被报道，Mourgues等首次通过农杆菌介导法成功地将GUS及nptII基因导入西洋梨康弗伦斯，并获得高达42.7%的遗传转化率。此后，梨的遗传转化普遍采用农杆菌介导法，即利用携带外源基因的农杆菌菌液侵染梨的外植体器官，然后对其进行再生培养，通过筛选后得到转基因植株。目前，梨中导入的外源基因主要为抗病、乙烯调控及矮化基因，并且在西洋梨、白梨、砂梨、秋子梨、杜梨中均取得梨转基因植株。

 

　　虽然前人在梨组织培养研究中取得了突破性进展，为梨无性系苗木繁育和遗传转化等研究奠定了坚实的基础，但在组培过程中还存在外植体褐化严重、增殖系数低、生根诱导困难和再生率低等问题。因此，在今后的梨组织培养研究中，应从基因型选择、基本培养基改良、不同植物生长调节剂的配比和培养方法创新等方面开展深入研究，以期有效解决上述问题，并将其更好地应用于梨无性系苗木的繁育和生物育种研究中。

 

　　声  明：本文摘编自《中国果树》2022年第5期“梨组织培养研究进展及其在育种中的应用”（叶宇，欧春青，王斐，张艳杰，马力，杨冠宇，李佳纯，姜淑苓）。